新冠病毒SARS-CoV-2造成了近一個(gè)世紀(jì)以來(lái)最具破壞性的大流行COVID-19，而其中尚未解決的科學(xué)問(wèn)題之一是這種病毒的自然來(lái)源。

近日，來(lái)自中科院武漢病毒所、中國(guó)科學(xué)院大學(xué)的研究人員在預(yù)印本網(wǎng)站BioRxiv上提交了一篇論文，題為“Identification of a novel lineage bat SARS-related coronaviruses that use bat ACE2 receptor”。他們報(bào)告在云南省墨江縣通關(guān)鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)的蝙蝠身上鑒定出的新的SARS-CoV-2相關(guān)病毒病毒譜系，這些病毒采樣于2015年，地點(diǎn)和研究團(tuán)隊(duì)此前報(bào)告的來(lái)源于中菊頭蝠、與SARS-CoV-2基因組一致性達(dá)96.2%的RaTG13系同一地點(diǎn)。

該論文的通訊作者為中科院武漢病毒所新發(fā)傳染病研究中心主任、武漢國(guó)家生物安全實(shí)驗(yàn)室（四級(jí)）副主任石正麗和中科院武漢病毒所蝙蝠病毒感染與免疫學(xué)科組組長(zhǎng)周鵬。

研發(fā)同時(shí)指出，根據(jù)現(xiàn)在的研究發(fā)現(xiàn)，目前發(fā)現(xiàn)的能被分離出的蝙蝠SARSr-CoV-2系或新譜系病毒均無(wú)法有效利用人類ACE2。因此，如果不進(jìn)行適應(yīng)，對(duì)人類的溢出風(fēng)險(xiǎn)還比較小。相比之下，從使用受體的情況來(lái)看，穿山甲冠狀病毒具有較高的溢出風(fēng)險(xiǎn)。

他們還進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)，盡管此前有推測(cè)稱，可能是實(shí)驗(yàn)室的RaTG13泄漏導(dǎo)致了SARS-CoV-2，但現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)證據(jù)并不支持這一推測(cè)。

石正麗等人在這項(xiàng)研究中強(qiáng)調(diào)，目前我們?cè)隍鹕砩习l(fā)現(xiàn)的SARS樣冠狀病毒可能只是冰山一角。未來(lái)應(yīng)進(jìn)行更系統(tǒng)性和縱向的監(jiān)測(cè)，防止病毒再次造成重大溢出事件。

不同于SARSr-CoV-1和SARSr-CoV-2的新譜系

論文中寫道，2015年5月，研究團(tuán)隊(duì)在墨江縣進(jìn)行蝙蝠采樣。蝙蝠在肛門拭子取樣后被釋放，樣品在-80°C條件下保存直到使用。

在蝙蝠中追蹤SARS-CoV-2起源時(shí)，研究團(tuán)隊(duì)此前發(fā)現(xiàn)了RaTG13，它與SARS-CoV-2的基因組同源性為96.2%，這是迄今為止最接近的基因組。

他們對(duì)2015年于同一地點(diǎn)采集的蝙蝠樣本進(jìn)一步調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，其中8個(gè)樣本的序列與SARS-CoV-2序列同源性為93.5%。7份來(lái)自小褐菊頭蝠（Rhinolophus stheno），另1份來(lái)自中菊頭蝠（Rhinolophus affinis）。

因此，他們進(jìn)行了下一代測(cè)序（NGS），以進(jìn)一步分析這些冠狀病毒，所有8個(gè)樣本均獲得全基因組序列。這8個(gè)SARSr-CoV基因組幾乎相同，彼此之間的序列一致性超過(guò)99.7%。研究團(tuán)隊(duì)以其中一株、被命名為RaTG15的病毒株為代表進(jìn)行了進(jìn)一步分析。

在用于冠狀病毒分類的7個(gè)保守復(fù)制酶結(jié)構(gòu)域中，RaTG15與SARS-CoV-2和SARS-CoV-1的同源性分別為95.3%和92.5%，表明其屬于冠狀病毒科Betacoronavirus屬的Sarbecovirus亞屬中的SARSr-CoV種。

此外，RaTG15在開(kāi)放閱讀框1b （ORF1b）與SARS-CoV-2基因接近。在完整的ORF1b區(qū)，RaTG15與來(lái)自中國(guó)和東南亞的野生蝙蝠SARSr-CoV-2的核苷酸序列同源性為84.6%-89.0%，氨基酸序列同源性為95.6%-97.3%，這其中包括來(lái)自云南的蝙蝠冠狀病毒RaTG13和RmYN02，日本的Rc-o319，柬埔寨的RshSTT182，泰國(guó)的RacCS203，以及兩個(gè)穿山甲冠狀病毒株。

研究發(fā)現(xiàn)，相比之下，除上述ORF1b外，RaTG15與SARSr-CoV-2和SARSr-CoV-1在大多數(shù)基因組中均有顯著差異。ORF1a、M和N的基因同源性低于80%，S、ORF3、6和7a/7b的同源性低于70%。

研究得出，總體而言，RaTG15全基因組與SARS-CoV-1序列同源性為74.4%，與SARS-CoV-2序列同源性為77.6%。值得注意的是，RaTG15和SARS-CoV-1在S、E、M、N和ORF6蛋白上的序列一致性比RaTG15和SARS-CoV-2之間的更高。

研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，RaTG15在內(nèi)的這一新的病毒譜系可能是不同SARSr-CoVs重組的結(jié)果。

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果也較好支持了這一點(diǎn)。研究團(tuán)隊(duì)指出， SARSr-CoVs此前主要由兩個(gè)亞譜系組成，即SARSr-CoV-1和SARSr-CoV-2。后者包括最近在亞洲許多地區(qū)報(bào)告的穿山甲和不同種類的菊頭蝠中的SARS-CoV-2。在全長(zhǎng)基因樹(shù)和S基因樹(shù)中，RaTG15及其相關(guān)病毒均遠(yuǎn)離上述現(xiàn)有的兩個(gè)亞譜系，由此形成一個(gè)新的譜系。

在沒(méi)有進(jìn)一步適應(yīng)的前提下人畜共患潛力有限

研究人員進(jìn)一步檢測(cè)了RaTG15的S蛋白序列，并與其他SARSr-CoV-2做了對(duì)比。

他們發(fā)現(xiàn)，RaTG15的S蛋白的受體結(jié)合域（RBD）與其他sarbecoviruses病毒高度不同，與SARS-CoV-2的氨基酸同源性為72.6%，與相關(guān)的蝙蝠和穿山甲冠狀病毒的氨基酸同源性為68.6%-73.3%。

值得一提的是，和上述提到的RmYN02、RacCS203不同的是，RaTG15 RBD沒(méi)有出現(xiàn)一種缺失，也就是對(duì)應(yīng)于SARS-CoV-2 S蛋白中的氨基酸473-486缺失（缺失2），根據(jù)此前的研究，該缺失決定對(duì)了血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）的利用。然而，和SARS-CoV-2和RaTG13相一致的是，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與氨基酸444-447（缺失1）相對(duì)應(yīng)的缺失。該處缺失的位置與柬埔寨RshSTT182的位置相似。

另外，在SARS-CoV-2與ACE2受體結(jié)合的5個(gè)氨基酸殘基中，RaTG15表現(xiàn)出有4個(gè)是不同的（486、493、494和501）。此外，與大多數(shù)蝙蝠SARSr-CoVs一樣，在RaTG15的S1-S2接合處沒(méi)有多堿基（furin）酶切位點(diǎn)。

論文提到，序列分析表明，RaTG15病毒可能使用ACE2作為進(jìn)入受體，研究人員也進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證試驗(yàn)。使用了來(lái)自SARS-CoV-2、SARS-CoV-1、RaTG13、pangolin-CoV-GD、pangolin-CoV-GX和RaTG15的RBD蛋白，以及人類和中菊頭蝠 ACE2蛋白的外區(qū)結(jié)構(gòu)域（圖S2A）。

他們發(fā)現(xiàn)，中菊頭蝠來(lái)源的RaTG13和RaTG15 RBD蛋白對(duì)人類ACE2 （HuACE2）的親和力很弱或沒(méi)有結(jié)合親和力。而兩種穿山SARSr-CoVs的RBD蛋白對(duì)HuACE2的結(jié)合親和力要高得多，僅略弱于SARS-CoV-2 RBD，但仍高于SARS-CoV-1。pangolin-CoV-GX對(duì)HuACE2的結(jié)合親和力略弱于pangolin-CoV-GD。

研究人員進(jìn)一步驗(yàn)證，相對(duì)于利用huACE2，蝙蝠冠狀病毒RaTG13和RaTG15是否能更有效地利用中菊頭蝠ACE2（RaACE2）？結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RaTG15 RBD與RaACE2的親和力也同樣明顯低于SARS-CoV-2和pangolin-CoV-GD/GX對(duì)RaACE2的親和力。與在HuACE2中一樣，RaTG13 RBD與RaACE2的結(jié)合很弱。

研究人員還進(jìn)行了假病毒感染試驗(yàn)。與RBD-ACE2蛋白結(jié)合分析一致，HuACE2介導(dǎo)了除RaTG15外的所有SARSr-CoVs的進(jìn)入，而中菊頭蝠ACE2支持所有SARSr-CoVs的進(jìn)入。

研究總結(jié)認(rèn)為，無(wú)論是SARSr-CoV-2譜系還是此次鑒定出的新譜系病毒，均不能有效結(jié)合HuACE2，RBD區(qū)域是否存在缺失似乎會(huì)極大地影響結(jié)合能力。

研究人員認(rèn)為，這些結(jié)果表明，如果沒(méi)有進(jìn)一步的適應(yīng)，蝙蝠來(lái)源的RaTG13、RaTG15以及其他可能的SARSr-CoV-2病毒，它們的人畜共患潛力尚有限。相比之下，從使用細(xì)胞受體的情況來(lái)看，穿山甲冠狀病毒具有較高的溢出風(fēng)險(xiǎn)。

實(shí)驗(yàn)證據(jù)不支持實(shí)驗(yàn)室泄漏導(dǎo)致SARS-CoV-2

總的來(lái)說(shuō)，該研究報(bào)告了從蝙蝠身上發(fā)現(xiàn)的一種新的SARSr-CoVs譜系，這些病毒與SARS-CoV-2在RdRp區(qū)域密切相關(guān)，但在基因組水平上與任何已知的SARSr-CoVs都還有距離。

研究人員指出，雖然已從野生動(dòng)物中檢測(cè)到幾種與SARS-CoV-2相關(guān)的冠狀病毒，但它們沒(méi)有一種在基因組水平上與SARS-CoV-2有99%的基因相同。

需要注意的是，冠狀病毒之間較易發(fā)生重組事件，這也被認(rèn)為是SARS-CoV-1的潛在起源。此前的非典溯源研究中，研究人員在蝙蝠中發(fā)現(xiàn)的SARSr-CoVs攜帶所有的SARS-CoV-1基因組片段。而不同野生動(dòng)物的部分基因組區(qū)域與SARS- CoV-2序列高度相似，也提示在跨物種或種間傳播的病毒進(jìn)化過(guò)程中可能病毒重組。

研究人員在論文討論部分指出，他們的研究結(jié)果表明，我們現(xiàn)在從蝙蝠身上發(fā)現(xiàn)的SARSr-CoVs可能只是冰山一角。這些病毒可能在動(dòng)物宿主中經(jīng)歷了選擇或重組事件，使病毒對(duì)新宿主產(chǎn)生適應(yīng)，然后傳播到新物種，直到它們進(jìn)入人類社會(huì)。

他們強(qiáng)調(diào)，應(yīng)該對(duì)此次鑒定出的新譜系病毒進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以防止未來(lái)疫情的暴發(fā)。因?yàn)閬?lái)自SARSr-CoV的另外兩個(gè)譜系的病毒，即SARS-CoV-1、SARS-CoV-2，分別導(dǎo)致了非典和COVID-19。

此外，根據(jù)現(xiàn)在的研究發(fā)現(xiàn)，目前發(fā)現(xiàn)的能被分離出的蝙蝠SARSr-CoV-2系或新譜系病毒均無(wú)法有效利用人類ACE2，因此，如果不進(jìn)行適應(yīng)，對(duì)人類的溢出風(fēng)險(xiǎn)還比較小。相比之下，蝙蝠SARSr-CoV-1相關(guān)譜系中能利用ACE2的病毒在跨物種傳播方面似乎更危險(xiǎn)。

研究提到，RaTG13是現(xiàn)階和SARS-CoV-2最接近的蝙蝠冠狀病毒，但對(duì)HuACE2仍僅表現(xiàn)出很弱的結(jié)合親和力。

他們強(qiáng)調(diào)，盡管此前有推測(cè)稱，可能是實(shí)驗(yàn)室的RaTG13泄漏導(dǎo)致了SARS-CoV-2，但現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)證據(jù)并不支持這一推測(cè)。相比之下，穿山甲冠狀病毒對(duì)人類或蝙蝠ACE2具有很強(qiáng)的結(jié)合能力，對(duì)人類或其他物種具有很高的跨物種潛力。

研究人員分析，在SARS-CoV-2來(lái)源于動(dòng)物的這一背景下，可能存在一種比RaTG13更有效使用HuACE2的蝙蝠SARSr-CoV，或者有一種具備更高基因序列一致性的穿山甲冠狀病毒。

研究最后強(qiáng)調(diào)，今后需要對(duì)蝙蝠、穿山甲或其他可能的中間宿主動(dòng)物進(jìn)行更系統(tǒng)和縱向的抽樣調(diào)查，防止未來(lái)由SARSr-CoV相關(guān)病毒造成的溢出事件，也可以更好地了解SARS-CoV-2的來(lái)源。

論文鏈接：https：//www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.05.21.445091v1